Молекулярно-генетичні методи

Відео: Генетичні дослідження

Методи ДНК-технології використовують для з`ясування локалізації в тій чи іншій хромосомі мутантного гена, відповідального за походження певних форм спадкової патології. Так як ген являє собою ділянку ДНК, а мутація генів - пошкодження первинної структури ДНК (під мутацією розуміють всі зміни в послідовності ДНК, незалежно від їх локалізації і впливу на життєздатність індивіда), то, зондуючи препарати метафазних хромосом хворого з спадковим захворюванням, вдається встановити локалізацію патологічного гена. Методи молекулярної генетики створюють можливості для діагностики хвороб на рівні зміненої структури ДНК, вони дозволяють з`ясовувати локалізацію спадкових порушень. Молекулярно-генетичні методи можуть виявити мутації, пов`язані з заміною навіть одного-єдиного підстави.

Відео: Молекулярно-генетичні особливості НМРЛ. Методи їх детекції

Найважливіший етап ідентифікації гена - його виділення. ДНК може бути ізольована з будь-якого типу тканин і клітин, що містять ядра. Етапи виділення ДНК включають: швидкий лізис клітин, видалення за допомогою центрифугування фрагментів клітинних органел і мембран, ферментативне руйнування білків і їх екстрагування з розчину за допомогою фенолу і хлороформу, концентрування молекул ДНК шляхом преципітації в етанолі.

У генетичних лабораторіях ДНК найчастіше виділяють з лейкоцитів крові, для чого у пацієнта забирають 5-20 мл венозної крові в стерильну пробірку з розчином антикоагулянту (гепарин). Потім відокремлюють лейкоцити і проводять їх обробку за викладеними вище етапах.

Відео: Конференція Застосування молекулярної генетики для допоміжних репродуктивних технологій

Наступний етап підготовки матеріалу до дослідження - «розрізання» ДНК на фрагменти в ділянках зі строго специфічною послідовністю підстав, яке здійснюють за допомогою бактеріальних ферментів - рестрикційних ендонуклеаз (рестриктаз). Рестріктази дізнаються специфічні послідовності з 4-6, рідше 8-12 нуклеотидів в двухцепочечной молекулі ДНК і поділяють її на фрагменти в місцях локалізації цих послідовностей, званих сайтами рестрикції. Кількість які виникають рестрикційних фрагментів ДНК визначається частотою зустрічальності сайтів рестрикції, а розмір фрагментів - характером розподілу цих сайтів по довжині вихідної молекули ДНК. Чим частіше розташовані сайти рестрикції, тим коротше фрагменти ДНК після рестрикції. В даний час відомо більше 500 різних типів рестриктаз бактеріального походження, і кожен з цих ферментів дізнається свою специфічну послідовність нуклеотидів. Надалі сайти рестрикції можуть бути використані в якості генетичних маркерів ДНК. Утворилися в результаті рестрикції фрагменти ДНК можуть бути впорядковані по довжині шляхом електрофорезу в агарозному або поліакриламідному гелі, а тим самим може бути визначена їх молекулярна маса. Зазвичай для виявлення ДНК в гелі використовується специфічне забарвлення (частіше бромидом етидія) і перегляд гелю в світлі ультрафіолетової області спектра. Місця локалізації ДНК мають червоне забарвлення. Однак у людини при обробці ДНК кількома рестріктазамі утворюється так багато фрагментів різної довжини, що їх не вдається розділити за допомогою електрофорезу, тобто не вдається візуально ідентифікувати окремі фрагменти ДНК на електрофор-грамі (отримують рівномірне фарбування по всій довжині гелю). Тому для ідентифікації потрібних фрагментів ДНК в такому гелі використовують метод гібридизації з міченими ДНК-зондами.

Будь одноланцюговий сегмент ДНК або РНК здатний зв`язуватися (гібридизувати) з комплементарної йому ланцюгом, причому гуанін завжди пов`язується з цитозином, аденін з тиміном. Так відбувається утворення дволанцюгової молекули. Якщо одноцепочечную копію клонованого гена помітити радіоактивною міткою, вийде зонд. Зонд здатний відшукувати комплементарний сегмент ДНК, який потім легко ідентифікувати за допомогою радиоавтографии. Радіоактивний зонд, доданий до препарату розтягнутих хромосом, дозволяє локалізувати ген на певній хромосомі: за допомогою ДНК-зонда можна ідентифікувати певні ділянки при Саузерн-блот. Гібридизація відбувається, якщо тестований ділянку ДНК містить нормальний ген. У разі, коли присутній ненормальна послідовність нуклеотидів, тобто відповідні структури хромосоми містять мутантний ген, гібридизація не відбудеться, що дозволяє визначити локалізацію патологічного гена.

Відео: Молекулярно генетичні особливості отечно инфильтративной форми раку молочної залози

Для отримання ДНК-зондів використовують метод клонування генів. Суть методу полягає в тому, що фрагмент ДНК, відповідний якому-небудь гену або ділянці гена, вбудовують в клонують частку, як правило, бактеріальну плазміду (кільцева Позахромосомна ДНК, яка присутня в клітинах бактерій і несуча гени стійкості до антибіотиків), і потім бактерії, мають плазміду з вбудованим людським

геном, розмножують. Завдяки процесам синтезу в плазмиде вдається отримати мільярди копій людського гена або його ділянки.

У подальшому отримані копії ДНК, мічені радіоактивної міткою або флюорохромами, використовують в якості зондів для пошуку комплементарних послідовностей серед досліджуваного пулу молекул ДНК.

В даний час існує безліч різновидів методів з використанням ДНК-зондів для діагностики генних мутацій.