Молекулярно-генетичні дослідження

Мета проведення молекулярно-генетичних методів дослідження - визначення наявності модифікацій і змін в деяких хромосомах, ДНК-ділянках або генах. Широке використання на практиці цей спосіб роботи з ДНК отримав в 70-80 рр. минулого століття.

Коли призначають молекулярно-генетичні дослідження

Молекулярно-генетичні дослідження допомагають діагностувати:

1. Моногенні генетичні захворювання;
2. Імовірність розвитку онкологічних хвороб;
3. Наявність факторів, що провокують мультифакторні хвороби.

Визначення ризику розвитку онко-процесів за допомогою молекулярно-генетичного дослідження виявляє:

• ризик розвитку раку шлунка і щитовидної залози;
• Імовірність виникнення раку товстої кишки і ранніх стадій цього захворювання;
• Генетичну схильність до розвитку раку тіла матки, яєчників, молочної і передміхурової залози;
• Наявність рекомбінації генів ABL / BCR, що виявляються при лейкозі;
• Наявність передумов, що забезпечують ефективність протипухлинної терапії гефатінібом при наявності немелко-клітинного раку.

Проводячи молекулярно-генетичні тести на наявність генетично обумовлених передумов розвитку мультифакторних захворювань, вдається виявити ризик розвитку:

• гіпертонічної хвороби;
• прееклампсії;
• ревматоїдного артриту;
• остеопорозу;
• порушень ліпоїдного обміну;
• цукрового діабету 1 і 2 типу;
• хвороб репродуктивної системи.

За допомогою цього методу оцінюють метаболізм і виправданість застосування тих чи інших лікарських препаратів.

Кому призначають молекулярно-генетичні дослідження

Молекулярно-генетичні тести показані особам:

• страждаючим безпліддям;
• піддаються впливу несприятливих факторів навколишнього середовища;
• мають в роду близьких родичів, що страждають онкологічними, психічними, судинними і ендокринними захворюваннями.

Як проводиться молекулярно-генетичний тест

Відео: 7 ЗАСІДАННЯ (16.04.2015) Класичні і молекулярно-генетичні методи дослідження мікрофлори

Перший етап молекулярно-генетичного аналізу дуже важливий і полягає в отриманні РНК і ДНК зразків, які являють собою окремі фрагменти ДНК клітини або всю її ланцюжок. Для виділення необхідної кількості фрагментів використовують спосіб ампліфіцірованія, тобто їх розмноження шляхом полімеразної ланцюгової реакції (ферментативна реплікація).

Для аналізу молекул ДНК потрібно їх попереднє поділ на частини і обробка бактеріальними ендонуклеаза (рестріктазамі) - ферментами, які можуть розрізати подвійну спіраль ДНК на частини по 4-6 пар.

Фрагменти ДНК розділяють по довжині і розміром за допомогою спеціального гелю (поліакріламідного і агарозного), застосовуючи електрофорез. Під дією останнього вони переміщаються вниз по гелю з різною швидкістю, залишаючи за собою дискретну смугу.

Молекулярно-генетичні дослідження спадкових патологій також використовують з метою вивчення людського геному. Блот-гібридизація по Саузерну дозволяє в даному випадку визначити необхідні для цього особливі фрагменти ДНК. При цьому спочатку вдаються до денатурації ДНК, в результаті чого отримують фрагменти у вигляді одного ланцюжка і їх переносять на фільтр (нейлоновий або нітроцелюлозні), який замочений в буферному розчині.

Гель, на якому знаходяться ДНК-фрагменти, переносять на фільтрувальний папір з сольовим розчином (з високим% концентрації). Зверху накладається по черзі нітроцелюлозний фільтр і фільтрувальна, але суха папір (для вбирання сольового розчину). В результаті одноцепочечниє ДНК залишаються на фільтрі в такому ж становищі як на гелі.

Для виявлення необхідних фрагментів проводять процедуру гібридизації ДНК з клонованою його фрагментом або радіоактивних ДНК-зондом. Отриманий результат цієї процедури виявляється за допомогою радиоавтографии, завдяки якій всі комплементарні зонди послідовності ДНК відображаються у вигляді радіоактивної смуги.

Відео: Вебінар. 19.02.2014. Молекулярно генетичні дослідження в практиці акушера гінеколога

Метод Саузерн дозволяє відтворити рестрикційну карту геному людини в певній частині гена. Це дає можливість виявити наявність будь-яких дефектів в самому гені. Розроблені методи вважаються досить ефективними і дозволяють проводити надточну діагностику спадкових захворювань. З цією метою з ембріональних клітин, які містяться в амніотичної рідини, виділяють ДНК. В подальшому її гібрідізіруют, застосовуючи Саузерн-блот з радіоактивним ДНК-зондом. В результаті дуже легко розпізнати аномальний ембріон, тому що його ДНК гібрідізіруют виключно з ДНК-зондом, який є комплементарним мутантною послідовності.

Сучасна наука використовує ряд методів для виявлення мутацій. Всі вони діляться на непрямі і прямі молекулярно-генетичні методи дослідження.

Непрямі методи виявлення мутацій використовуються в разі, якщо відомо положення гена на генетичній карті, але не розшифрована його нуклеотидная послідовність.

Пряма діагностика буває в кількох видах:

1. Секвенування. Це техніка виявлення нуклеотидної послідовності для визначення заміни підстав в певному фрагменті.
2. Блот-гібридизація але Саузерну. Це рестріктний аналіз, за допомогою якого знаходять мутації, які мають порушення місця рестрикції.
3. Аллелоспеціфіческая гібридизація з синтетичним зондом. Даний спосіб також дозволяє виявити в геномної ДНК мутації.
4. Електрофорез двухцепочечной ДНК в гелі (Рівномірно денатурує, нейтральному). Воно являє собою розщеплення ДНК на хімічному і ферментативном рівні. У тих місцях, де неправильно зшиті підстави зазвичай визначають групу мутацій.
5. Вивчення електрофоретичної рухливості ДНК-мутантних молекул.
6. Аналіз синтезованого білка за допомогою електрофорезу. Про наявність мутацій судять по зміні рухливості білка в системі in vitro.

Також мутації діагностують за допомогою визначення поліморфних фрагментів (рестрикційних по довжині) в геномі. Для цього застосовують ту ж техніку блот-гібридизації за Саузерну.

Відео: Лабораторія для ДНК-експертиз з`явилася в МВС по Марій Ел - Вести Марій Ел

Серед інших типів поліморфізму ДНК також виділяють мікросателіти. Вони являють собою короткі послідовності ДНК (тандемно повторювані моно-, ди-, три- і тетрануклеотідние). Вони служать маркерами дефектних мутацій або маркерними локусами алельних варіантів гена в дослідженні.

Ген, який відповідальний за розвиток хореї Гентингтона, важкої патології, був відкритий в 1993 р При цій хворобі спостерігається зниження інтелектуального розвитку, розлад рухів ЦНС у людей після 40 років. Хвороба є спадковою і передається по аутосомно-домінантним типом, має 100% пенетрантність. Розташований ген хвороби в 4-й хромосомі, в короткому плечі.

Цей ген включає в себе нуклеотидну послідовність у вигляді багаторазового повторення нуклеотиду ЦАГ. У здорових людей таких повторів в нормі 11-34, хворі хореей мають 37-86, але зазвичай 45. З цього випливає висновок, що хорея Гентингтона - це спадкова патологія з мутацією гена в багаторазовому збільшенні числа його копій (експансія).